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1 前言

培養(yǎng)基，是指供給微生物、植物或動(dòng)物（或組織）生長(zhǎng)繁殖的，由不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組合配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。一般都含有水、氮源、無(wú)機(jī)鹽（包括微量元素）、碳源、生長(zhǎng)因子（維生素、氨基酸、堿基、抗菌素、色素、激素和血清等）等。培養(yǎng)基既是提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。其中培養(yǎng)基中氨基酸的檢測(cè)受到廣泛關(guān)注，本解決方案參考標(biāo)準(zhǔn) “YY/T 1695-2020 人類輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械培養(yǎng)用液中氨基酸檢測(cè)方法” 中的氨基酸分析方法和標(biāo)準(zhǔn) “GB5009.28-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定” 中的蛋白沉淀方法，給出了培養(yǎng)基樣品預(yù)處理和 HPLC 在線分析測(cè)試方法。

依利特使用新推出的 EClassical 3200 液相色譜儀和經(jīng)典的 Supersil AQ-C18 色譜柱，為培養(yǎng)基中氨基酸檢測(cè)提出了分析檢測(cè)解決方案，供相關(guān)人員參考使用。

2 儀器設(shè)備與試劑

3 樣品中的氨基酸含量檢測(cè)

3.1 樣品制備

3.1.1 樣品蛋白沉淀

稱 2 g 樣品于 50 mL 容量瓶中，加入 25 mL 水，超聲溶解后加入蛋白沉淀劑（亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液各 2 mL），混勻后用離心機(jī) 8000 r/min 離心 5 min，清液轉(zhuǎn)移至 50 mL 容量瓶中。于殘?jiān)鼉?nèi)加入 20 mL 水，混勻后超聲 5 min，用離心機(jī) 8000 r/min 離心 5 min，清液轉(zhuǎn)移至之前的 50 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。

3.1.2 樣品衍生

精密量取對(duì)照品溶液 50 μL，置于 5 mL 塑料離心管中，精密加入 0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 10.2）250 μL，混勻，精密加鄰苯二甲醛溶液 50 μL，混勻，放置 30 s，精密加入芴代甲氧基酰氯溶液 50 μL，混勻，放置 30 s，精密加稀釋劑 400 μL。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備

市售 18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其衍生方式同樣品衍生方法。

3.3 溶液配置

1. 流動(dòng)相 A：稱取十二水合磷酸氫二鈉 4.5 g，十水合四硼酸鈉 4.75 g，加水 1000 mL，用鹽酸調(diào) pH 至 8.2。
2. 流動(dòng)相 B：取甲醇 450 mL，乙腈 450 mL，水 100 mL，混勻。
3. 0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 10.2）：取硼酸 24.73 g，加水 800 mL 溶解，用 40% 氫氧化鈉溶液調(diào) pH 至 10.2，然后加水稀釋至 1000 mL。
4. 鄰苯二甲醛溶液：取鄰苯二甲醛 80 mg，乙酰半胱氨酸 97 mg，加 0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH 10.2）7 mL，加乙腈 1 mL 溶解。
5. 芴代甲氧基酰氯溶液：取芴代甲氧基酰氯 40 mg，加乙腈 8 mL 溶解。
6. 稀釋液：取流動(dòng)相 A 100 mL，加磷酸 0.5 mL，混勻。
7. 0.1 mol/L 鹽酸溶液：取鹽酸 9 mL，加水適量使成 1000 mL，搖勻。
8. 0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液：稱取 4 g 氫氧化鈉，加新沸過(guò)的冷水使成 1000 mL，搖勻。

3.4 色譜條件

流動(dòng)相梯度

• 色譜柱：Supersil AQ-C18 5 μm 4.6×150 mm
• 檢測(cè)波長(zhǎng)：338 nm（0-31 min，一級(jí)氨基酸）；262 nm（31-40 min，二級(jí)氨基酸）
• 進(jìn)樣體積：40 μL
• 柱溫：50 ℃

4 18 種氨基酸混標(biāo)測(cè)試（實(shí)驗(yàn)）結(jié)果

18 種氨基酸分析譜圖

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)參考標(biāo)準(zhǔn) “YY/T 1695-2020 人類輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械培養(yǎng)用液中氨基酸檢測(cè)方法” 中的氨基酸分析方法和標(biāo)準(zhǔn) “GB5009.28-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定” 中的蛋白沉淀方法，對(duì)培養(yǎng)基中氨基酸成分進(jìn)行分析檢測(cè)。測(cè)試結(jié)果數(shù)據(jù)符合標(biāo)準(zhǔn)要求，結(jié)果表明：該系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，定量結(jié)果準(zhǔn)確。

完整方案（PDF 版）下載提示

上述內(nèi)容為《柱前在線衍生法檢測(cè)培養(yǎng)基中氨基酸的含量》全文原樣呈現(xiàn)，完整 PDF 文檔額外包含以下核心資源，點(diǎn)擊鏈接即可獲?。?/span>

高清資料：18 種氨基酸混標(biāo)分析高清譜圖（含各氨基酸峰標(biāo)注、保留時(shí)間詳情）、實(shí)際培養(yǎng)基樣品檢測(cè)原始譜圖；

操作指南：蛋白沉淀分步操作視頻、柱前衍生反應(yīng)實(shí)操演示、色譜柱活化與維護(hù)教程；

拓展數(shù)據(jù)：18 種氨基酸線性方程（R2≥0.999）、檢出限 / 定量限報(bào)告、加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)（88%-95%）、精密度驗(yàn)證結(jié)果（RSD＜2%）；

附錄文件：YY/T 1695-2020、GB5009.28-2016 標(biāo)準(zhǔn)原文節(jié)選、儀器操作安全規(guī)范、耗材訂貨清單（色譜柱、試劑、濾膜型號(hào)編碼）。

下載通道

直接下載：www.bbc65.com/ 培養(yǎng)基氨基酸檢測(cè)方案

技術(shù)咨詢：400-66-35483